封閉及雜交

在做雜交時，個人建議：還是使用雜交袋進行一抗和二抗的孵育，這樣節約抗體。

操作開始：

1. 將膜用 TTBS 從下向上浸濕后，移**含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉 1 h。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和 TTBS 將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白 marker 則可省略此步。

2. 將一抗用 PBST 稀釋**適當濃度（在 1.5 ml 離心管中）；撕下適當大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育 1～2 h 后，用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min。

3. 同上方法準備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育 1～2 h 后，用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min，進行化學發光反應。