什么是PCR儀？

PCR儀優化樣品條件以增強目標核酸序列的擴增，以進行定量和定性分析。熱循環儀設計用于執行兩種類型的聚合酶鏈式反應 (PCR) 方法：終點或標準 PCR 和實時 qPCR。

標準 PCR儀可擴增目標 DNA 或 RNA 序列，但不包括用于實時測量擴增速率的軟件（或檢測器）。

實時 qPCR 與標準 PCR儀

實時熒光定量 PCR 系統和標準 PCR 系統有什么區別？

實時 PCR 系統定量 PCR 反應進行時產生的目標 DNA 或 RNA 的拷貝數，建立與反應中擴增開始呈指數增加時的點相關的 Ct 值（或閾值循環）。因此，實時 PCR 系統提供樣品的定性和定量檢查，而標準 PCR 系統僅提供樣品的定性分析。

標準 PCR 系統包括樣品塊（與微孔板、微管或 PCR 條兼容）、加熱和冷卻元件以及板載控制器。熱量通過 Peltier 效應在元件和樣品塊（包含樣品）之間傳遞，確保快速升溫和冷卻速率以及嚴格的溫度容差。

實時熒光定量 PCR 系統的功能還包括樣品塊、加熱/冷卻元件和控制器，以及光源（通常是鎢燈）、濾光片和光檢測器。實時 PCR儀的板載軟件包括附加功能，可在反應發生時繪制反應結果圖表，將擴增曲線作為 Ct 值分配給每個陽性樣本。

聚合酶鏈式反應 - 標準與實時 PCR 反應

在將樣品裝入PCR儀之前，PCR 反應必須包含多種試劑（或預混液）以確保目標序列的成功擴增。對于標準 PCR 反應，樣品必須包括目標核酸、無核酸酶（PCR 級）水、dNTP（二核苷酸三磷酸）、DNA 聚合酶和設計用于結合目標基因上游和下游的定制寡核苷酸序列。對于實時 PCR 反應，樣品必須包含上述每種試劑，以及設計用于與目標序列退火的熒光探針或報告分子。

定義的標準 PCR 協議步驟

聚合酶鏈式反應 (PCR) 技術的標準方案是什么？

標準 PCR 方案包括一個初始步驟，然后是一個精確的 2 步溫度序列，重復 40 個循環。第一步或變性步驟包括將樣品加熱至 95°C 3 分鐘，以將雙鏈目標 DNA 分離或變性成單鏈。第二步，稱為退火步驟，包括將樣品冷卻至 60°C，這是引物和 DNA 聚合酶與靶序列結合或退火的理想溫度。第三步或延伸步驟涉及將樣品加熱到 72°C，以允許 DNA 聚合酶使用 dNTP（或二核苷酸三磷酸）形成新的 DNA 互補鏈。退火和延伸步驟重復 39 個額外的循環，以形成數百萬個目標 DNA 序列拷貝。

定義的實時 PCR 協議

實時 PCR 協議反映了標準 PCR 協議，但有一個例外：退火步驟還涉及熒光探針或報告分子與目標 DNA 鏈的結合。由于 DNA 聚合酶在延伸步驟中形成新的互補鏈，探針會發出特定波長的光。當反應通過 40 個循環協議進行時，檢測器會測量光，從而使研究人員可以按需分析每個樣品中的放大率。由于實驗方案的不同而存在一些差異，正常的 PCR 運行時間在 90 到 100 分鐘之間。

PCR儀的板載軟件

安裝在標準 PCR儀上的板載軟件包括反應方案的輸出、定義當前反應步驟的狀態指示器和估計的完成時間。更高級的標準熱循環儀包括用戶定義的協議、密碼保護和溫度優化向導。

標準與實時 PCR 應用

標準和實時熒光定量 PCR 用于各種應用，包括法醫學、環境科學、臨床診斷（例如 COVID 檢測）、克隆、基因分型、突變檢測（用于癌癥篩查）和親子鑒定。

A - 放大方法

A1 - 實時 qPCR

在實時定量 PCR 中，目標序列或擴增子在反應進行到完成時進行測量，每個循環后進行拷貝數定量。

實時熒光定量 PCR 的優勢是什么？

實時 PCR 不需要額外的、冗長的終點檢測步驟，例如凝膠電泳，但為研究人員提供了比傳統 PCR 更少的步驟的定量和定性樣品分析。該過程比標準 PCR 成本更高，但該協議不那么費力，提供按需分析（用于時間敏感的研究），并且不易發生交叉污染。

A2 - 標準終點 PCR

在標準 PCR 或常規終點 PCR 中，使用終點分析檢測 DNA 靶序列或擴增子，通常通過凝膠電泳完成。常規 PCR 提供樣品的定性分析，但不提供定量評估。該過程比實時 PCR 成本更低，但該協議更長、更費力并且更容易受到樣品交叉污染的影響。

B - PCR儀板容量

PCR儀包括與不同數量的微管、PCR 條和微孔板兼容的板塊。Biometra 的 TAdvance 熱循環儀具有快速更換、可互換的板塊，與 96 孔和 384 孔微孔板、0.5 ml 微管和 0.2 ml PCR 條兼容。Biometra 的 TRIO PCR儀具有三個不同的板塊，允許用戶靈活地并行運行三個獨立的 PCR 協議。Biometra TRIO 上的每個板塊最多可容納 48 個樣品。